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    1. 蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司

      16年專注生物實驗室儀器設備&耗材綜合供應

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      昆蟲細胞質粒DNA提取和酶切的完整實驗步驟
      作者: 編輯: 來源: 發布日期: 2023.09.14
      信息摘要:
      昆蟲細胞質粒DNA提取和酶切是一種常用的實驗方法,用于研究昆蟲基因組和基因功能。昆蟲細胞通過裂解,釋放DNA。接著,使用DNA提取試劑盒提取…

      昆蟲細胞質粒DNA提取和酶切是一種常用的實驗方法,用于研究昆蟲基因組和基因功能。昆蟲細胞需要被裂解,釋放DNA。接著,使用DNA提取試劑盒提取DNA,純化得到目標DNA。然后,通過酶切反應使用限制性內切酶對DNA進行切割。這些步驟將可用于進一步的實驗,如PCR擴增和DNA測序,以研究昆蟲基因的結構和功能。

      一、昆蟲細胞質粒DNA提取

      實驗材料:

      - 1.5ml細菌培養物

      - 100 μl溶液I50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0

      - 200 μl溶液II0.2 mol/L NaOH,1SDS

      - 150 μl溶液III60 ml 5 mol/L乙酸鉀,11.5 ml 冰乙酸,28.5 ml H2O

      - 70%乙醇

      - ddH2O

      - 0.5μl RNase

      -質粒提取試劑盒

      步驟:

      1. 1.5ml細菌培養物,4000rpm離心1分鐘,棄上清液,使細菌沉淀盡量干燥。

      2. 將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 μl溶液I中,劇烈振蕩。

      3. 加入200 μl溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,使溶液II與細菌完全混合,置于冰浴中。

      4. 加入150 μl溶液III,蓋緊管口,反復顛倒數次,使溶液III在細菌裂解物中均勻分散,置于冰上3-5分鐘。

      5. 在最大轉速下離心5分鐘,取上清液于另一個新的管中。

      6. 用兩倍體積的乙醇沉淀DNA,振蕩混合,室溫放置2分鐘,最大轉速離心5分鐘。

      7. 小心吸去上清液,倒置于濾紙上,使所有液體都流出。

      8. 加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀,振蕩混合,用12000g離心2分鐘,棄上清液,放置于室溫使乙醇揮發,直至EP管內沒有可見液體存在(5-10分鐘)。

      9. 0.5μlRNase37℃溫育5-10分鐘。

      10. 使用電泳儀設備進行瓊脂糖電泳鑒定。

      二、昆蟲細胞質粒DNA酶切

      實驗材料:

      - 待切樣品DNA

      - 10×緩沖液

      - 限制性內切酶

      - ddH2O

      步驟:

      1. 酶切前確定待切樣品的濃度,并選擇合適的限制性內切酶和配套緩沖液。

      2. 在離心管中加入如下成分:10×緩沖液1μl、待切樣品xμl、酶0.5-1μl,加水補足10μl。

      3. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

      4. 將離心管置于37℃中溫育1-3小時,若待切樣品為PCR產物,則可延長反應時間。

      5. 用未酶切的質粒作為對照,進行瓊脂糖電泳鑒定酶切結果。

      三、昆蟲細胞質粒DNA連接

      實驗材料:

      - 待連接的樣品(膠回收產物或PCR產物,載體與片段的mol比為13-5

      - 10×連接緩沖液

      - T4連接酶

      - ddH2O

      步驟:

      1. 連接前先使用電泳儀確定待連接載體與片段的濃度。

      2. 在離心管中加入如下成分:10×連接緩沖液1μl、待連接的樣品xμl、連接酶0.5-1μl,加水補足10μl。

      3. 混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

      4. 將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當的時間(根據不同公司的酶的要求而定,一般為221-3小時或16℃連接過夜)。

      5. 連接完的樣品可直接用于轉化,也可放于4℃冰箱短期保存。

      通過以上實驗步驟,可以實現昆蟲細胞質粒DNA的提取、酶切和連接,為后續的PCR擴增等實驗。

      四、PCR擴增

      實驗材料:

      - 連接完的樣品

      - PCR反應體系所需試劑(Taq聚合酶、引物、反應緩沖液等)

      - ddH2O

      -PCR儀

      步驟:

      1. 準備PCR反應體系,根據實驗需要確定反應體系組份和體積,同時設計合適的引物。

      2. PCR反應管中加入反應體系所需試劑,如Taq聚合酶、引物和反應緩沖液等。

      3. 加入連接完的樣品,注意控制反應體系中DNA的濃度。

      4. 加入適量的ddH2O補足反應體系總體積。

      5. 進行PCR擴增反應,根據引物設計的溫度條件選擇合適的PCR程序。

      6. 擴增結束后,取10μl反應產物進行瓊脂糖電泳分析,確認PCR擴增結果。

      五、DNA回收與純化

      實驗材料:

      - PCR反應產物

      - 天根DNA回收試劑盒(如PCR純化試劑盒)

      步驟:

      1. 準備天根DNA回收試劑盒,根據試劑盒說明書中的步驟進行操作。

      2. PCR反應產物加入DNA回收試劑盒提供的柱子或管子中,進行離心分離。

      3. 緊接著,根據試劑盒的要求,采用洗滌緩沖液進行洗滌步驟,去除雜質。

      4. 使用洗滌緩沖液洗滌后,將柱子或管子中的DNA進行洗脫,得到純化后的DNA樣品。

      5. 使用瓊脂糖電泳儀鑒定純化后的DNA樣品的質量和濃度。

      通過以上實驗步驟,你可以將昆蟲細胞質粒DNA經過PCR擴增,然后進行DNA回收與純化,得到純凈的DNA樣品,用于后續的分析、測序等實驗。

      實驗總結:

      這個實驗步驟詳細介紹了昆蟲細胞質粒DNA的提取、酶切、連接、PCR擴增以及DNA回收與純化的過程。這些步驟需要仔細操作,以確保提取的DNA質量和純度。此方法適用于小量質粒DNA的提取,提取的質粒DNA可直接用于酶切和PCR擴增。在實驗過程中,注意控制反應條件,如時間、溫度和試劑濃度,以確保實驗結果的準確性。然后使用天能瓊脂糖電泳進行分析,以確認提取的DNA的質量和濃度。

       蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司是一家專注于提供實驗室設備、實驗耗材和實驗試劑的綜合性公司。我們引領著實驗器材行業的發展,為科研人員提供高質量、高效率的實驗室解決方案。

      除了日常供應的實驗室設備主要包括:冷凍離心機、低速離心機、微量離心機、大容量離心機、 迷你離心機移液器、移液槍、Rainin移液、 液體處理工作站、移液工作站、 磁力攪拌器、加熱攪拌器、電動攪拌器、 恒溫攪拌器、恒速攪拌器、 多功能攪拌器、搖床恒溫振蕩器、 氣浴振蕩器、水浴振蕩器、 調速振蕩器、回旋振蕩器、漩渦振蕩器、 混勻振蕩器、微量振蕩器、 大容量振蕩器、多功能振蕩器、凝膠電泳儀、電泳儀、電泳槽、 核酸純化系統、核酸提取儀、 PCR儀、基因測序儀、電穿孔儀、基因導入儀、 DNA合成儀、 蛋白質純化系統、細胞融合儀、蛋白印跡儀、化學發光儀、流式細胞儀、細胞分析儀、細胞計數儀、 超凈工作臺、生物安全柜、發酵罐、 細胞破碎儀、 細胞生物反應器、生化培養箱、光照培養箱、 恒溫培養箱、 電熱培養、隔水式培養箱、CO2培養箱、 冷凍培養箱、 振蕩培養箱、低溫培養箱、人工氣候箱、 霉菌培養箱、 培養搖床、多功能培養箱、厭氧培養箱、 粉碎機、 破碎機、研磨儀、球磨機、組織研磨器等核心產品。

        我們提供梅特勒瑞寧Rainin吸頭,以其穩定的和可靠性贏得了廣泛的認可。不僅如此,我們還引進了耐思Nest品牌的細胞培養耗材、PCR耗材、搖瓶、細胞工廠、離心管等豐富系列產品。這些產品采用耐用的材料和精確的制造工藝,確保了實驗的穩定性和準確性。

         此外,我們還提供天根核酸提取試劑盒、PCR Taq酶以及各種酶等生物試劑。我們的產品經過嚴格的質量控制,確保了其在實驗過程中的穩定性和可靠性。碧云天生化試劑和Biosharp生化試劑則是我們配套的實驗試劑,可滿足您在生物研究過程中的各種需求。

      為了保證實驗環境的清潔與安全,我們提供了哈爵雅消毒劑系列產品,包括乙醇消毒液、異丙醇消毒液、過氧化氫消毒液、復方季銨鹽(L)消毒液、復方過氧化物消毒液等等。這些產品能夠有效地殺滅細菌和病毒,保護實驗器材和樣本的安全。

       除了耗材外,我們還提供國產CHO細胞、HEK細胞、腫瘤細胞株等細胞產品服務,致力于為生物領域的科學家提供全方位的支持和解決方案。 



      蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司成立于2008年,位于蘇州園區生物納米園(Biobay)A5幢301室。公司管理團隊專注于科學儀器行業十四年,擁有專業的技術團隊與完善的售后服務體系,目前已為300余家實驗室提供優質產品和服務,涵蓋各大高校、檢測中心、科研機構、制藥企業等13個群體。提供的實驗室儀器主要包括振蕩培養箱,恒溫恒濕培養箱、二氧化碳培養箱、生化培養箱、霉菌培養箱、PCR儀,瑞寧移液器,生物反應器,發酵罐,超低溫冰箱,液氮罐,高壓滅菌器,超純水機,天平,離心機,離心濃縮儀、研磨機、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業授權包括知楚儀器、朗基、中科美菱,梅特勒,樂楓,搏旅、NEST、天根、奧盛在內的80個余廠家。

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