細胞培養技術-細胞培養常見問題解答

1. 冷凍管應如何解凍？ 

　　取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

2. 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？

　　除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基？ 

　　不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4. 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？

　　不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6. 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？  

　　一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用 10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7. 何時須更換培養基？ 

　細胞培養技術：視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

8. 培養基中是否須添加抗生素？

    除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。

9. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

　　一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

10. 懸浮性細胞應如何繼代處理？

　　一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

11. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

　　欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)， 5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。

12. 細胞之接種密度為何？ 

　　依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13. 細胞冷凍培養基之成份為何？

　　動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

14. DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 

　　冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO ( 如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

15. 冷凍保存細胞之方法？ 

　　冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80 ℃16~18 小時(或隔夜 ) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

　　冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃  至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase 長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 -80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

　　冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17. 應如何避免細胞污染？

　　細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

18. 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？ 

　　加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。

19. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

　　不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

20. 支原體污染會對細胞培養有何影響？ 

　　支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

21. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？

　　定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

更多細胞培養技術，細胞培養瓶相關問題，可以撥打0512-62956104或18934597460咨詢。

蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司成立于2008年，位于蘇州園區生物納米園（Biobay）A5幢301室。公司管理團隊專注于科學儀器行業十四年，擁有專業的技術團隊與完善的售后服務體系，目前已為300余家實驗室提供優質產品和服務，涵蓋各大高校、檢測中心、科研機構、制藥企業等13個群體。提供的實驗室儀器主要包括振蕩培養箱，恒溫恒濕培養箱、二氧化碳培養箱、生化培養箱、霉菌培養箱、PCR儀，瑞寧移液器，生物反應器，發酵罐，超低溫冰箱，液氮罐，高壓滅菌器，超純水機，天平，離心機，離心濃縮儀、研磨機、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業授權包括知楚儀器、朗基、中科美菱，梅特勒，樂楓，搏旅、NEST、天根、奧盛在內的80個余廠家。